Genų redagavimo CRISPR technologija gali būti plačiai taikoma siekiant padidinti augalų ir gyvūnų produktyvumą, atsparumą neigiamiems veiksniams bei norint gydyti kai kurias genetines ligas. Tačiau šios genų redagavimo technologijos taikymas nėra paprastas.

Genų redagavimo metodas CRISPR-Cas9, prie kurio atradimo ypač reikšmingai prisidėjo Vilniaus universiteto prof. Virginijaus Šikšnio vadovaujama mokslinė grupė, leidžia tiksliai pakeisti DNR seką. Taikant šio pobūdžio technologiją susiduriama su reguliaciniais, etiniais ir visuomenės požiūrio iššūkiais.

Nemaža dalis žmonių skeptiškai vertina GMO (genetiškai modifikuotas organizmas), todėl labai svarbu pažymėti, kad CRISPR technologija nesukuria GMO. Tai yra tikslingas genų redagavimo metodas, leidžiantis keisti organizmo DNR, nenaudojant svetimos rūšies genetinės medžiagos.

CRISPR technologija JAV jau yra pripažinta ne kaip genų modifikavimo, o kaip jų redagavimo būdas, kai klaidų genome ištaisymas lemia teigiamus pokyčius. Nors šiuo metu Europos Sąjungoje reglamentavimas yra griežtesnis, Europos Komisija bando jį pakeisti taip, kad CRISPR pagalba redaguoti augalai, jei įvesti pokyčiai yra tolygūs atsirandantiems natūraliai, nebūtų laikomi GMO.

Prof. Virginijaus Šikšnio mokslinės grupės narys Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto vyresnysis mokslininkas dr. Giedrius Gasiūnas patikslina, kad genų redagavimas – tai saugus DNR pokytis ir jis nesukels tokių pakitimų, kokių negalėtume natūraliai aptikti gamtoje.

Genomas – organizmo genetinė medžiaga, sudaryta iš DNR (kai kurių virusų – RNR). Ląstelei dalijantis, kiekviena dukterinių ląstelių įprastai gauna identišką genomo kopiją. Į genomą įeina baltymus koduojantys genai. Genome aptinkama ir nebeveikiančių, evoliucijoje prarastų genų liekanų. Žmogaus genomą arba, kitaip tariant DNR, koduoja milijardas nukleotidų.

Augalininkystėje rezultatų dar teks palaukti

Daug kur pasaulyje augalai jau redaguojami pasitelkus CRISPR. Europos Sąjungoje registruoti bulvių ir kukurūzų genetiniai (atsparumo) tyrimai priskiriami prie genetiškai modifikuotų organizmų tyrimų. Tad dėl griežto reglamentavimo ES, praktikoje rezultatų dar teks palaukti.

Pasak LAMMC mokslininko dr. Vidmanto Bendoko, pagrindinis dalykas, ko tikisi augalininkai – žemės ūkio augalų atsparumas ligoms, neigiamiems veiksniams ir derlingumo padidinimas, prisitaikymas prie besikeičiančio klimato. „Tai kryptys, kuriomis verta dirbti. Sukūrę atsparius ligoms žemės ūkio augalus, taupysime chemikalų, labiau tausosime aplinką. Tinkamos visos kultūros. Augalas pats yra sudėtingas organizmas, jį transformuoti yra sunkiau. Tam reikia žinių, didelio kiekio duomenų ir gebėjimo juos analizuoti. Kita vertus, augalus reikia auginti, tad tam reikia ne tik uždarų patalpų, bet ir natūralių sąlygų“, – teigia dr. V. Bendokas.

CRISPR-Cas9 gyvulininkystėje

VDU Gamtos ir technologijos mokslų tyrimų instituto direktorius prof. habil. dr. Algimantas Paulauskas pasakoja, kad genų inžinerija gyvulininkystėje pradėta taikyti apie 1990 m. Bandyti įvairūs genų perkėlimo metodai. Tam naudoti eksperimentiniai gyvūnai: graužikai, nematodai (kitaip – apvaliosios kirmėlės, bestuburių gyvūnų tipas, labai didelis rūšių skaičiumi), kiaulės. Daugiausia dirbta su pelėmis.

Šiuolaikinis naujausias metodas – genų redagavimas – gali būti taikomas keleriopai. Viena galimybių – modifikuoti gyvūnų organus transplantacijai. Tai bandyta atlikti su kiaulėmis, nes pats kiaulės organizmas panašus į žmogaus, atitinka organų dydis. Tačiau kiaulės užauga ir žmogaus dydį pasiekia per pusmetį. Naudotos recipiento (sergančio žmogaus) kamieninės ląstelės, kurios įkeltos į kiaulę ir pagal tą patį genomą užaugintas organas.

Kita kryptis – ūkinių gyvūnų produktyvumo, atsparumo ligoms didinimas. Vienas iš sėkmingesnių pavyzdžių, tiesa, ne su ūkiniais gyvūnais, – kova su maliarija. Darbai atlikti Floridoje (JAV). Naudojant genų inžineriją modifikuoti uodai: į gamtą išleisti sterilūs patinai, kurie gali apvaisinti pateles, bet palikuonių nebus.

Dar viena genų redagavimo pritaikymo kryptis – paveldimų ligų gydymas. Džiugi žinia, jog CRISPR-Cas9 genų redagavimu paremtas gydymas jau yra taikomas žmonėms, sergantiems tokiomis kraujo ligomis kaip pjautuvinė anemija ir beta-talasemija. Kadangi paveldimų ligų turi ir galvijai bei kiti gyvūnai, šioje srityje taip pat vykdomi moksliniai tyrimai, siekiant sukurti inovatyvius – CRISPR paremtus gydymo metodus.

Vienas iš pažengusių yra mokslinis angusų veislės galvijų gydymo eksperimentas. Jį atlieka kompanija „Angenetics“. Siekiama ne tik gydyti paveldimas ligas, bet ir padidinti mėsos išeigą, plaukuotumą, kuris svarbus galvijus auginant atvirose vietose. Tyrimai vyksta su Aberdyno angusų veislės galvijais ir dažniausiai keičiant kiaušialąstes.

„Kita genų inžinerijos sritis galvijininkystėje – atsparumas patogenams. Taip pat siekiama išspręsti labai aktualią galvijininkystės problemą, susijusią su ŠESD, tai mikrobiotos (t. y. viso žarnyno mikroorganizmų sudėties) pakeitimai. Taikyti genetiškai modifikuotus mikroorganizmus galvijų virškinamajame trakte ir kitur.

Taip pat galvojama pereiti prie mikrobiotos genetinės modifikacijos žmonėms gydymo tikslais. Čia lengviau sprendžiami etiniai klausimai, nes keičiama tik mikrobiota, bet nekeičiamas pačio šeimininko genomas“, – teigia prof. A. Paulauskas.

Kas yra genų „žirklės“

Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto mokslininkai dr. Giedrius Gasiūnas, dr. Tomas Šinkūnas ir dr. Tautvydas Karvelis, vadovaujami prof. Virginijaus Šikšnio, 2017 m. pelnė Lietuvos mokslo premiją už darbų ciklą „CRISPR-Cas sistemų tyrimai: nuo bakterijų imuniteto iki genų redagavimo technologijos“.

Lietuvių mokslininkų atrasta technologija leidžia, panaudojant Cas9 baltymą, redaguoti organizmų DNR dešimtis kartų greičiau nei tai buvo daroma iki šios technologijos atsiradimo. CRISPR sistemos atveria naujas galimybes genetinių ligų gydymui ar siekiant išvesti naujas augalų ir gyvūnų veisles.

„Nuskaityti genomą (tiek žmonių, tiek augalų, tiek gyvūnų genetines sekas) mokslininkai gali gana greitai. Genomas – tai organizmo DNR sekų visuma. DNR sekas galima įsivaizduoti kaip žodžius, sudarytus iš keturių „raidžių“ – nukleotidų: A (adenino), T (timino), C (citozino) ir G (guanino). Šios keturios raidės užrašo visą gyvybės kodą, t. y. jos užrašo genus, genai koduoja baltymus, kurie vykdo fermentines reakcijas bei sudaro visos ląstelės struktūrą ir iš esmės nulemia ląstelės vystymąsi“, – paprastai sudėtingus dalykus paaiškina dr. Giedrius Gasiūnas.

CRISPR-Cas9 technologija leidžia įvesti nedidelius, tokius, kokius norime, pokyčius į genomą.

Kaip tai veikia? „Dažnai CRISPR technologija yra prilyginama universalioms genų žirklėms. CRISPR-Cas9 sistemą sudaro dvi dalys: baltymas, kerpantis DNR grandinę kaip žirklės, ir RNR molekulė (ji yra DNR „giminaitė“), atpažįstanti tam tikrą tikslinę DNR seką. Keisdami RNR (programuodami) galime nukreipti baltymą į tą genomo vietą, į kurią norime. Tai sunki užduotis, nes žmogaus genomą sudaro daugybė – apie 3,5 mlrd. nukleotidų, – sako mokslininkas. – Dažnai žmogaus ligą gali sukelti vos vienas pasikeitęs nukleotidas iš 3,5 mlrd. Todėl, norint gydyti tokią ligą, būtina itin tiksliai nukreipti baltymą į tą konkrečią nukleotido vietą. Kai baltymas perkerpa DNR, natūraliai įsijungia DNR pažaidų taisymo mechanizmai, kurie gali būti pasitelkiami koreguojant klaidą genome.

Kalbant apie augalus, jie paprastai būna poliploidai, todėl genomai gali būti dar didesni. Tačiau nesvarbu, ar yra 3 ar 10 mlrd. nukleotidų, gali užtekti pakeisti vieną ar kelis nukleotidus, kad pasikeistų augalo požymis: aukštis, derlingumas, atsparumas ar kt.

Nukleotidai (lot. nucleus – branduolys) – organinių junginių grupė, nukleozidų ir fosforo rūgšties esteriai. Laisvi nukleotidai ląstelėje atlieka daug svarbių funkcijų: gali būti energijos šaltinis (ATP, GTP), dalyvauti angliavandenių biosintezėje (UTP, ATP), perduoti signalą (cAMP, cGMP), modifikuoti baltymus (ATP).

Sukeliamos mutacijos, kurios gali vykti ir gamtoje

Per tuos metus, kai išmoko skaityti genomus, mokslininkai pamatė, kad visuose organizmuose natūraliai vyksta mutacijos. Nukleotidai keičiasi. Bet... kartais tas pokytis būna kenksmingas, kartais neutralus, o kartais ir naudingas.

„Pavyzdžiui, žinome, kad ultravioletiniai spinduliai žmonėms kenkia. Jie pažeidžia mūsų DNR, ląstelė taiso tą pažeidimą, bet taisydama suklysta ir taip atsiranda mutacija. Daugeliu atveju mutacijos būna neutralios, bet kartais gali turėti ir reikšmingą efektą. Ilgus metus naujų augalų veislių išvedimas rėmėsi atsitiktinai sukeliamomis mutacijomis: veikiant medžiagoms (mutagenams), arba švitinant gama spinduliuote. Sukėlus mutacijas, atrenkamas augalas, kuris turi naujų pageidaujamų požymių. Tokių atsitiktinių mutacijų įvedimas naudojant tradicinę mutagenezę ES teisės yra leidžiamas“, – teigia dr. G. Gasiūnas.

Genų redagavimas suteikė galimybę dirbtinai įvesti mutacijas, kurios galėtų atsirasti natūraliai, ir tai padaryti tiksliai toje vietoje, kurioje mums reikia.

„Jeigu žinome, kad, pakeitus nukleotidą ar pašalinus dalį DNR sekos, augalas gali tapti atsparesnis sausrai, vienas iš tradicinių būdų tai pasiekti yra sėklų švitinimas. Tokiu atveju atsitiktinai sukeliamos mutacijos, sėjama daug augalų ir atrenkami tie, kurie pasižymi didesniu atsparumu sausrai. Tačiau jei žinome, koks genas veikia ar kokia mutacija yra reikalinga, genų žirklės leidžia mutaciją tikslingai įvesti į norimą vietą“, – pabrėžia mokslininkas.

Mokslininkai geba atskirti natūraliai galinčius susidaryti genetinius pokyčius nuo tokių, kurie nėra būdingi gamtai, todėl genų redagavimo metu siekiama įvesti tik tuos pokyčius, kurie galėtų atsirasti natūraliomis sąlygomis. Vis dėlto gali nutikti, kad žirklės kirps ne ten, kur reikia. Tokie atvejai yra tiriami eksperimentiškai ir į rezultatus kreipiamas didelis dėmesys. Atsižvelgiant į šiuos iššūkius, mokslininkai CRISPR sistemas tobulina ir stengiasi, kad įrankiai būtų kuo tikslesni.

Nors technologiškai įvesti mutacijas ir jas sukontroliuoti galima, dabar sudėtingiausias klausimas – suprasti, kokius pokyčius įvesti, ką redaguoti, kad gautume norimą pokytį, norimą efektą. Tam pasitelkiamas ir dirbtinis intelektas.

„Kartais yra vieno nukleotido pokytis, kartais – keleto. Suprasti ryšį yra sudėtingiausia“, – atvirai moksliniais iššūkiais dalijasi dr. G. Gasiūnas.

Paklaustas, kas dar Lietuvoje plėtoja šią technologiją, mokslininkas pamini, kad su prof. V. Šikšniu yra įkūrę biotechnologijų įmonę „Caszyme“, kur irgi vystomi CRISPR paremti sprendimai, taikomi įvairiose srityse, orientuojantis ir į mediciną: žmonių terapijas ir ligų gydymą.

Prof. V. Šikšnio iniciatyva Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centre įsikurė Europos molekulinės laboratorijos partnerystės institutas, skirtas plėtoti naujas genomo redagavimo tyrimų ir taikymų kryptis. Siekiant plėsti CRISPR-Cas tyrimus ir taikymo sritis, į šį institutą buvo pritraukti šeši užsienio mokslininkai.

***

Genų inžinerijos raida

Gamtos ir technologijos mokslų tyrimų instituto direktorius prof. habil. dr. Algimantas Paulauskas išskiria pagrindinius genų inžinerijos etapus.

Pirmasis genų perkėlimo metodas – tai kito organizmo tam tikros DNR dalies perkėlimas tiesiai į ląsteles. Ląstelės dauginasi ir vyksta procesas: ląstelės dalijimosi, branduolio išsiardymo ir susirinkimo iš naujo (gamtoje toks procesas būdingas kai kuriems pirmuonims). Jei gamtoje nėra lytinio dauginimosi, tai išsiardo visas branduolys ir mikrobranduolėlis, kurie (visa genetinė medžiaga) susikuria iš naujo. Toks panašus principas taikytas ir dirbtinai – sušvirkštus dalį svetimos DNR, kuri kažkur išsilieja.

Problema, kad vadinamosios mikroinjekcijos į ląstelės branduolį vykdavo neaišku kurioje vietoje, neaiškus susijungimo procentas. Eksperimentai, atlikti su graužikais, nedavė rezultatų, nes iš 100 tik 1 ar 2 pavykdavo. Bandymai su kiaulėmis taip pat nepasiteisino.

Vėliau buvo sukurtas klonavimas. Avytė Doli ir kiti eksperimentai buvo susiję su galimybe užauginti gyvūną paėmus branduolį iš kito organizmo (iš kitos ląstelės). Avytės Doli atveju iš tešmens perkeltas branduolys, neutralizavus (pašalinus) lytinėse ląstelėse esantį branduolį. Tada įkėlus naują branduolį ir jį sužadinus elektrošoku ar cheminiu būdu ląstelė pradėdavo dalintis. Taip buvo įrodyta, kad galima perkelti kitą genetinę medžiagą į ląstelę ir ji užauga.

Avytė Doli susidūrė su problemomis: veikė genetinis laikrodis, ji gyveno trumpiau, buvo agresyvesnė.

Trečias metodas buvo perkėlimas jau modifikavus branduolį arba ląstelių įkėlimas iš kitur. Naudotos kamieninės ląstelės, kadangi jų augimą ir dauginimąsi tam tikroje stadijoje galima paveikti. Pavyzdžiui, blastulės stadijoje galima įkelti nebūtinai visą organizmą, bet tik tas ląsteles, iš kurių formuosis, tarkime, širdis, inkstai ir kt.

Panaudota kserotransplantacija (ksero – svetimas). Bandyta į tokios pat stadijos ląsteles įkelti kito organizmo ląsteles. Vyko bandymai su kiaulėmis, Anglijoje – su šimpanzėmis. Pakeitus ląsteles, kurios formuoja širdį ar inkstus, pavyzdžiui, į kiaulės ląsteles įdėtos šimpanzės širdies branduolio ląstelės ir gautos vadinamosios chimeros (chimerinis organizmas). Jos užaugo. Pradėta galvoti apie tokio metodo taikymą ir žmonėms, kai trūksta donorų. Vis dėlto rezultatas nedidelis – tik 4–6 proc. prigyja.

Vėliau atsirado tikslesnių genų perkėlimo būdų. Tačiau iškilo GMO problema. Kita vertus, sunku buvo nustatyti, ar pavyko įkėlimas. Tam pradėta naudoti antibiotikams atsparaus geno (kaip žymeklis) perkėlimas kartu su norimo požymio geno DNR. Su augalais tokius bandymus atlikti paprasčiau, nes galima naudoti selektyvias su antibiotikais terpes. Tačiau nuo 2007 m. Europos Sąjungoje antibiotikams atsparaus geno naudojimas su augalais buvo uždraustas.

Prieš uždraudimą atsirado dar vienas mokslinis tyrimas – žaliai fluorescuojantis baltymas (baltymas, kuris, veikiamas šviesoje nuo mėlynos iki ultravioletinės spinduliuotės, pasižymi žalia fluorescencija). Už šį atradimą 2008 m. amerikiečiams Osamu‘ui Shimomura‘ai, Martin‘ ui Chalfie‘ui ir Roger‘ui Y. Tsien‘ui paskirta Nobelio premija.

Panaudoję šį baltymą tyrėjai rado būdų, kaip stebėti procesus, kurie anksčiau buvo neįžiūrimi – tai tokie procesai kaip nervų ląstelių vystymasis ar vėžio plitimas.

Taigi plėtojantis genų inžinerijai, perkeliant ląsteles, buvo įkeliamas ir žaliai fluorescuojančio baltymo žymuo. Švytėjimas yra lengvai atskiriamas požymis-žymeklis, pagal kurį galima pamatyti, ar gyvūnas paveldėjo ligą ar kitą svarbią, bet taip lengvai nepamatomą savybę. Jei įsikėlė žaliai fluorescuojantis baltymas, galime tikėtis, kad įsikėlė ir kita genetinė medžiaga.

Apie 2011 m. gimė genetiškai modifikuoti šuniukai, kuriems įkelti redaguoti genai panaudojus žaliai fluorescuojantį baltymą.

Net ir tada vis dar išliko problema, nes nepavyko sužinoti, kur įsikėlė didelė dalis genetinės medžiagos. Taip galėjo kilti įvairių mutacijų (mokslininkai vartoja posakį „rėmelių postūmis“, kai pasikeičia nukleotidas ir gali būti sintetinamos kitos aminorūgštys ir kitoks baltymas), pvz., atsiranda hemofilija (kraujavimo liga, kurią sukelia kraujo krešėjimo faktoriaus trūkumas). Taigi, vien tokia nedidelė mutacija pakeičia savybes.

Šios problemos vis dar buvo neišspręstos iki prof. V. Šikšnio sukurto CRISPR-Cas9 genų redagavimo metodo. Čia galime pakeisti vieną nukleotidą ir jau žinodami tiksliai seką.

***

Abejotina informacija siekiant populiarumo

Neseniai žiniasklaidoje ir socialiniuose tinkluose pasklido informacija, kad gimė praeityje gyvenusių rūšių vilkiukai. VDU Gamtos ir technologijos mokslų tyrimų instituto direktorius prof. habil. dr. Algimantas Paulauskas tvirtai teigia, kad senoji rūšis tikrai neatkurta. „Į šiuolaikinių šunų ir vilkų genomą įkelta tik tam tikra dalis genų, kurie panašūs į kažkada gyvenusios rūšies. Iš tiesų tai visai kita rūšis, seniai gyvenusių rūšių atkurti mes negalėsime, nes reikia viso genomo, kuris vystėsi evoliucijos eigoje. Net jei rastume ir paimtume dalį, tarkime, iš ledynų kokio seniai egzistavusio gyvūno, to padaryti nepavyktų, nes tai būtų tik dalis per evoliuciją susikūrusio genomo“, – aiškina profesorius.

Neatkursime, deja, nei mamutų, nei dinozaurų. Nes neturime viso genomo. Jis yra suiręs (nes yra biologinės kilmės). Jei yra keletas genomo fragmentų ir naudojamas kitas organizmas (taip buvo padaryta su senąja vilkų rūšimi), tai didžioji dalis genų yra naujo organizmo.

„Taip mes galime sukurti nežinia ką. Ypač jei eksperimentuojame su plėšriaisiais gyvūnais ar kitais, kurie gali sukelti riziką, jie sudarys nišinę populiaciją, kuri neturi priešų, neturi gamtos reguliavimo mechanizmų, kils problemų. Pavyzdys galėtų būti į Australiją įvežtos nendrių rupūžės iš Pietų Amerikos kontroliuoti cukranendrių vabzdžius kenkėjus. Šios rupūžės ginasi nuodais, dėl ko kai kurių vietinių rūšių (paukščių, gyvačių, driežų) labai sumažėjo. Tai nebuvo numatyta“, – dalijasi žiniomis prof. A. Paulauskas.

2025-05-01